Кириченко А.К., Бардецкая Я.В., Фефелова Ю.А., и др.

Обоснование

Акне является одним из наиболее распространенных хронических рецидивирующих заболеваний кожи, основными этиологическими факторами этого заболевания считаются характер секреции сальных желез и гиперандрогения [1]. Локальный синтез стероидных гормонов осуществляется в целом ряде органов, основные функции которых не относятся к эндокринной регуляции. Хорошо известно, что кожа выполняет важную нейроэндокринную функцию [2]. Синтез стероидов начинается с транспорта холестерина с внешней митохондриальной мембраны к внутренней, где он подвергается ферментативному превращению в прегненолон, предшественника всех стероидных гормонов [3]. Это ключевой этап стероидогенеза, катализируемый цитохромом P450scc (CYP450scc, CYP11A1). Экспрессия данного фермента была обнаружена у людей в различных органах: в плаценте, почках, поджелудочной железе и коже. Присутствие CYP11A1 предполагает возможность синтеза стероидов de novo в отличие от метаболизма стероидов, продуцируемых в других органах, что наблюдается во многих типах клеток [4]. Помимо цитохрома CYP11A1 в начальном процессе стероидогенеза принимают участие несколько белков. Транспорт холестерина через наружную и внутреннюю митохондриальные мембраны представляет собой лимитирующий этап стероидогенеза. Митохондрии являются клеточными органеллами со сравнительно невысоким содержанием холестерина. В митохондриях стероидпродуцирующих клеток холестерин взаимодействует с так называемым холестерин-связывающим доменом белка TSPO. Именно в этом участке холестерин продвигается к матриксной стороне внутренней митохондриальной мембраны, где под воздействием фермента CYP11A1 превращается в прегненолон — предшественника всех стероидных гормонов. Предполагается, что в транспорте холестерина через митохондриальную мембрану также участвует белок StAR, локализующийся на наружной митохондриальной мембране и взаимодействующий с TSPO [5].

Ранее нами показано, что действительно, как нормальные, так и опухолевые клетки кожи экспрессируют белки, участвующие в синтезе стероидных гормонов. В опухолевых клетках определялся пониженный уровень CYP11A1 и белков TSPO, DBI, также участвующих в стероидогенезе [6]. Однако механизмы и причины этого, в равной степени как и роль локального синтеза стероидных гормонов в развитии злокачественных новообразований кожи, остаются малоизученными. Далее нами выполнены исследования в отношении определения содержания белков, участвующих в синтезе стероидных гормонов, при акне. Было показано, что в эпидермисе и в себоцитах экспрессируется фермент 21-гидроксилаза, который принимает участие в синтезе кортизола и альдостерона. Согласно выполненному нами исследованию, уровни 21-гидроксилазы повышались в десять раз в эпидермисе больных акне вне зависимости от тяжести течения заболевания по сравнению с контролем [7]. Ранее мы показали, что уровень цитохрома Р450scc в кератиноцитах повышался при тяжелой форме акне [8].

Акне вульгарные — это заболевание, характеризующееся обструкцией и воспалительным поражением сальных желез [1]. Его характерные особенности включают гиперплазию сальных желез с повышенной скоростью продукции кожного сала, чрезмерную колонизацию Propionibacterium acne и развитие перифолликулярного воспаления [9]. Формирование гиперплазии сальных желез рассматривается как результат действия андрогенов с последующим увеличением выработки кожного сала [10]. Структура и функционирование сальных желез находятся под строгим контролем биологически активных андрогенов: дегидроэпиандростерон (ДГЭА), андростендион и тестостерон стимулируют секрецию кожного сала [11]. Синтез андростендиона и тестостерона, прогестерона из прегненолона катализируется 3β-гидроксистероиддегидрогеназой (3βHSD) (рис. 1). Выделяют два типа данного фермента. Активность 3βHSD типа I была обнаружена в плаценте, молочных железах, печени, головном мозге, коже и некоторых других органах, тогда как 3βHSD типа II присутствует только в надпочечниках и гонадах [12]. Дальнейшее превращение тестостерона, катализируемое 17-β-гидроксистероиддегидрогеназой (17βHSD), приводит к образованию наиболее активного андрогена — дигидротестостерона. Воздействие андрогенов на себоциты приводит к дифференцировке последних с дальнейшим синтезом кожного сала [13].

Таблица. Иммунореактивность TSPO, StAR у пациентов с акне и в контрольной группе

* — значимо (тест Манна–Уитни) по сравнению с контрольной группой (p ≤ 0,05) (* — significant (Mann-Whitney U test) as compared to control group (p ≤ 0.05).

Источниками андрогенов в сальных железах являются циркулирующие андрогены, синтезируемые гонадами и надпочечниками, но себоциты также могут вырабатывать стероиды [14]. В целом ряде исследований показано нарушение способности вырабатывать гормоны в коже пациентов с акне. Тенденция к повышению 17βHSD и 5-альфа-редуктазы обнаружена в коже больных с акне [15]. Повышение уровня компонентов системы кортиколиберина — белка, связывающего КРГ, рецепторов КРГ, определялось у больных акне, особенно в клетках кожи и сальных желез [16]. Повышенный уровень 11-β-гидроксистероиддегидрогеназы I типа (HSD11β1) (фермента, с помощью которого кортизол превращается в кортизон) обнаружен в пораженной коже пациентов с акне, а ингибирование данного фермента снижало синтез липидов в себоцитах, влияя также на интенсивность воспаления [17]. Хотя до сих пор нет полного представления о функционировании кожи как органа стероидогенеза при нормальных и патологических состояниях, многие исследователи указывают на возможное влияние нарушений в экспрессии и активности компонентов локального стероидогенеза на некоторые дерматологические заболевания, в частности акне [11, 15].

В этой связи целью данного исследования стал анализ распределения и экспрессии белков, участвующих в стероидогенезе, в коже здоровых лиц и пациентов с акне.

Методы

25 пациентов с акне (5 мужчин и 20 женщин; средний возраст 23,3 ± 4,9; диапазон от 13 до 35 лет) были включены в это исследование после получения письменного информированного согласия. Пациенты не принимали никаких местных или пероральных препаратов в течение как минимум 1 месяца до начала исследования. Исследование было одобрено этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета и проведено с соблюдением этических принципов Хельсинкской декларации.

Клиническая оценка

Степень тяжести акне оценивалась по 4-балльной шкале: 1 — только комедоны; 2 — комедоны и умеренные папулопустулезные элементы; 3 — пустулы и комедоны / папулы; единичные узлы; 4 — выраженные папулы и кисты, конглобатные угри [18]. 9 пациентов (36%) имели акне 3-й степени, 16 пациентов (64%) — 4-й степени.

Иммуногистохимический анализ

Образцы кожи пациентов с акне и здоровых людей из контрольной группы (n = 38), полученные из области грудной клетки, для дальнейшего иммуногистохимического анализа фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, подвергали дегидратации в серии спиртов и заливали парафином. Срезы толщиной 3–4 мкм предварительно инкубировали с блокатором эндогенной пероксидазы (набор IHC для определения HRP/AEC для мыши и кролика, Abcam®, Великобритания) в течение 15 мин и блокатором неспецифического связывания белков в течение 2 ч с целью снижения неспецифического фонового окрашивания. Затем срезы инкубировали в течение 18 ч при 4 °C с антителами против CYP11A1 (предоставлены профессором W.L. Miller), 3βHSD (Abcam®, Великобритания), TSPO (CiteAb, UK), StAR (ThermoFisher, USA). Промывки проводили в 1х фосфатно-солевом буфере (PBS) (Биолот, Российская Федерация). В дальнейшем срезы инкубировали с биотинилированными антителами в течение 1 ч (Abcam®) и с раствором AEC (Abcam®). Срезы контрастировали гематоксилином и помещали в монтирующую жидкость (Bio-Optica s.p.a., Италия).

Препараты анализировали с помощью микроскопа Olympus BX-41 при увеличении x600. Количество положительно иммуноокрашенных клеток определяли на 100 эпидермальных кератиноцитов или себоцитов. В положительных образцах окрашивание дополнительно классифицировалось как сильное (+++), умеренное (++) или слабое (+) с использованием иммуногистохимического (ИГХ) индекса, рассчитанного как процент (+++) клеток • 3 + (++) клеток • 2 + (+) клеток • 1 [19]. Оценка осуществлялась двумя специалистами на основе анализа полученных цифровых изображений. Цифровые изображения были получены с помощью камеры Infinity (Lumenera Corporation, Канада) и проанализированы с использованием коммерческого программного обеспечения Infinity Capture, Infinity Analyze (V.4.6.0).

Этическая экспертиза

Исследование разрешено Локальным этическим комитетом КрасГМУ от 08.11.2010.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью непарного t-критерия Стьюдента, U-критерия Манна–Уитни. Средние значения ИГХ индекса были представлены со стандартным отклонением. Значения p ниже 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

В коже пациентов с акне наблюдались гистологические изменения, характерные для данного заболевания, — гиперкератоз, обструкция сальных желез, наличие воспалительного инфильтрата.

Белок-транслокатор (TSPO) определялся гомогенно в эпидермисе, а также в сальных железах — в созревающих секреторных себоцитах, разрушающихся себоцитах, но не базальных. Определялась ядерная, цитоплазматическая локализация белка (рис. 2). Стероидогенный острый регуляторный белок (StAR) отчетливо локализовался перинуклеарно. В эпидермисе белок экспрессировался в клетках базального слоя, шиповатого и зернистого. В сальных железах определялась иммуновизуализация StAR в созревающих секреторных себоцитах и разрушающихся себоцитах (рис. 3). Уровень TSPO был повышен в эпидермисе, сальных железах пациентов с акне, уровень StAR оставался без изменений у пациентов с акне по сравнению с показателями контрольной группы.

В связи с участием CYP11A1 в метаболизме холестерина в прегненолон далее нами в клетках кожи определялось распределение CYP11A1 и фермента 3βHSD [7]. В эпидермисе клетки CYP11A1⁺ визуализировались в цитоплазме кератиноцитов всех слоев (рис. 4). Положительно иммуноокрашенные клетки также присутствовали в эпителиальных клетках волосяных фолликулов. Клетки сальных желез продемонстрировали положительное окрашивание на CYP11A1 более чем в 80% случаев в контрольной группе и группе пациентов с акне с локализацией в зрелых себоцитах (рис. 5, 6). Напротив, наличие 3βHSD в коже определялось преимущественно в сальных железах. В некоторых случаях наблюдалось слабое окрашивание кератиноцитов во всех слоях эпидермиса как в контроле, так и в коже пациентов с акне. Положительно окрашенные клетки в основном состояли из зрелых супрабазальных себоцитов (рис. 7).

Обсуждение

Роль эндокринных нарушений в продукции стероидных гормонов в патогенезе акне хорошо описана. Данные пациенты имеют повышенные уровни андрогенов в крови и коже: дегидроэпиандростерон сульфат, андростендион, тестостерон и дигидротестостерон были повышены у женщин с акне [20]. Уровни андростендиона и дегидроэпиандростерона коррелировали с тяжестью акне у мужчин [21]. Хотя акне считается андрогензависимым заболеванием, большинство исследований было сосредоточено на стероидах, вырабатываемых в надпочечниках и метаболизируемых сальными железами, тогда как стероидные гормоны, вырабатываемые кожей [22], также могут влиять на развитие акне.

В данном исследовании определялся уровень экспрессии стероидогенез-ассоциированных белков TSPO, StAR, а также ферментов 3βHSD, CYP11A1 в нормальной коже и коже пациентов с акне. Уровни TSPO повышались в эпидермисе пациентов с акне по сравнению с контрольной группой. В сальных железах TSPO также повышенно экспрессировался при акне. Наличие однотипной локализации трех белков, осуществляющих единый процесс лимитирующего этапа синтеза стероидных гормонов — транспорта холестерина через митохондриальную мембрану с последующим образованием прегненолона, указывает на возможность подобных процессов в коже, а также на сочетанное функционирование вышеуказанных трех белков. Уровень 3βHSD повышался в дифференцированных себоцитах в коже пациентов с акне [23]. Этот факт согласуется с наблюдаемой взаимосвязью между уровнями тестостерона, андростендиона и выраженности изменений на коже у больных акне [24], поскольку это может быть результатом повышенного метаболизма этих гормонов предшественниками 3βHSD.

Проведенное исследование показывает, что в коже пациентов с акне уровни вырабатываемых стероидов повышаются по мере прогрессии заболевания. Превращение прегненолона в прогестерон, а также синтез андростендиона и тестостерона катализируются 3βHSD. Данный фермент в коже определялся в основном в сальных железах. С другой стороны, экспрессия 3βHSD одновременно с экспрессией CYP11A1 в себоцитах может свидетельствовать о синтезе стероидов в коже de novo себоцитами/кератиноцитами и определять интенсивность продукции кожного сала. Этот факт может быть подтвержден другим наблюдением повышенного уровня холестерина в коже пациентов с акне [25].

Нарушения синтеза стероидных гормонов могут влиять не только на продукцию кожного сала, но и на выраженность воспаления/повреждения клеток кожи у пациентов с акне. Патогены могут способствовать синтезу КРГ с последующим повышением уровня провоспалительного интерлейкина-1β, фактора некроза опухоли-á и повышением синтеза адренокортикотропного гормона [26], что может вызвать дальнейшую активацию местного стероидогенеза в коже и поддерживать хроническое воспаление.

Заключение

Повышение уровня TSPO в коже больных акне наряду с другими ферментами, метаболизирующими стероиды, — 3βHSD, CYP11A1, может свидетельствовать об интенсификации синтеза стероидов в коже при данной патологии, а также об их вкладе в развитие хронического воспаления при акне.

источник