Обоснование. Ожирение считается неинфекционной пандемией, а рост его распространения представляет собой серьезную медико-социальную проблему. Высокие значения индекса массы тела тесно коррелируют с артериальной гипертензией и ее осложнениями, однако влияние ожирения на реализацию наследственной предрасположенности к гипертонической болезни (ГБ) остается слабо изученным.

Цель. Изучить ассоциации полиморфных локусов ММР с развитием ГБ у мужчин в зависимости от наличия ожирения.

Методы. Исследование проведено в дизайне «случай-контроль». В зависимости от наличия ожирения было сформировано две группы мужчин для исследования: с ожирением (больные ГБ – 323, контроль – 46) и без ожирения (больные ГБ – 241, контроль – 211). Всем мужчинам, включенным в исследование, проводилось генотипирование восьми полиморфных локусов MMP. Несинонимичные SNP выявляли при помощи онлайн-программы SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg/). Функциональное значение полиморфных маркеров оценивали при помощи сервиса HaploReg (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php), влияние локусов на уровень экспрессии – с использованием GTEx-portal (http://www.gtexportal.org).

Результаты. Установлено, что у мужчин с ожирением в формирование ГБ вовлечены аллель А (OR=2,01; р=0,01) и генотип GG (OR=0,42; р=0,01) полиморфного локуса rs11568818 гена ММР7. У мужчин без ожирения с развитием заболевания ассоциированы аллель 6А (OR=1,32, р=0,04) rs3025058 гена MMР3 и генотипы GG (OR=1,52; р=0,04) и GА (OR=0,63; р=0,03) rs17577 гена MMР9. Показано, что полиморфные локусы, ассоциированные с развитием ГБ, характеризуются значимым регуляторным потенциалом – они располагаются в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов, а также влияют на уровень экспрессии генов.

Заключение. Таким образом, в настоящем исследовании установлены ассоциации с развитием ГБ полиморфного локуса rs11568818 гена ММР7 у мужчин с ожирением и локусов rs3025058 MMР3 и rs17577 MMР9 у мужчин без ожирения.

ОБОСНОВАНИЕ

В настоящее время ожирение считается неинфекционной пандемией, а рост его распространения представляет собой серьезную медико-социальную проблему [1]. Известно, что среди больных ожирением повышен риск развития гипертонической болезни (ГБ), сахарного диабета, почечной недостаточности и др., при этом у мужчин риск развития осложнений в 3 раза выше по сравнению с женщинами [2–4]. Клинические и эпидемиологические исследования подтверждают тесную связь высоких значений индекса массы тела с повышением уровня артериального давления (АД) и развитием ГБ [5, 6]. Однако точные механизмы, определяющие повышение АД, ассоциированные с ожирением, остаются недостаточно изученными [7, 8].

Отложение избыточной жировой ткани в организме является сложным многокомпонентным процессом, при этом важную роль в опосредованном ожирением адипогенезе играют матриксные металлопротеиназы (ММР) [9]. Это группа структурно родственных цинк-зависимых протеиназ, обеспечивающих деградацию компонентов внеклеточного матрикса и участвующих в процессах ремоделирования, ангиогенеза, пролиферации, дифференцировки и метастазирования [10]. Ранее проведенные исследования показали вовлеченность генов ММР в развитие метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний [11–13], однако роль ожирения в реализации генетической предрасположенности к ГБ не была изучена. В связи с вышесказанным представляется актуальным изучение роли ожирения в характере ассоциаций полиморфных локусов генов-кандидатов ММР с развитием ГБ.

ЦЕЛЬ

Изучить ассоциации полиморфных локусов ММР с развитием ГБ у мужчин в зависимости от наличия ожирения.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Для осуществления поставленной цели нами было проведено обсервационное, одноцентровое, одномоментное, выборочное исследование в формате «случай–контроль».

Критерии соответствия

Пациенты с ГБ включались в соответствующую группу только после подтверждения диагноза лабораторно-инструментальными и клиническими методами обследования в соответствии с диагностическими рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) [14].

В исследование включались неродственные лица русской национальности, являющиеся уроженцами Центрально-Черноземного региона России. Жителями Центрального Черноземья считали потомков лиц, имевших два и более поколения предков, проживавших на данной территории [15]. Критериями соответствия группе больных ГБ были систолическое АД ≥140 мм рт. ст. и/или диастолическое АД ≥90 мм рт. ст. (ВНОК, 2010). Критериями исключения из анализируемой группы были наличие в анамнезе симптоматических и/или вторичных гипертензий, печеночной и/или почечной недостаточности. Критерием соответствия контрольной группе были уровень систолического АД <140 мм рт. ст. и уровень диастолического АД <90 мм рт. ст., критерием исключения из группы контроля – наличие у мужчины метаболического синдрома, аутоиммунных и онкологических заболеваний.

Условия проведения и продолжительность исследования

Формирование групп пациентов осуществлялось на базе кардиологического отделения ОГБУЗ БОКБ Святителя Иоасафа в период с 2013 по 2016 гг.

Описание медицинского вмешательства

Для всех мужчин, включенных в исследование, рассчитывали индекс массы тела (ИМТ, кг/м²), определяли уровни общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП), триглицеридов (ТГ). Содержание холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП) вычисляли по формуле Фридвальда. Образцы крови для биохимического анализа отбирались после 8-часового голодания, анализ проводился в Белгородской областной клинической больнице Святителя Иоасафа.

Забор крови для генетического анализа производили из локтевой вены пробанда в объеме 5 мл. Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование анализируемых полиморфных локусов осуществлялось с помощью полимеразной цепной реакции (real-time PCR) синтеза ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов. Всем больным с ГБ и мужчинам группы контроля проводилось генотипирование восьми полиморфных локусов MMP, которые были выбраны для исследования согласно представленным ранее критериям [16].

Анализ в подгруппах

В рамках исследования сформированные группы контроля и больных с ГБ были поделены на подгруппы в зависимости от наличия ожирения. Критерием включения в подгруппу пациентов с ожирением был ИМТ ≥30. Лица, у которых регистрировался ИМТ <30, включались в подгруппу без ожирения.

Этическая экспертиза

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета, протокол № 8 от 10.04.2013 г. Все участники исследования подписали информированное согласие.

Статистический анализ

Оценку соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга проводили при помощи критерия χ². Анализ частот аллелей и генотипов в группах мужчин с гипертензией и группе контроля проводили в таблицах сопряженности 2×2 с использованием χ²-критерия с поправкой Йетса на непрерывность. Проведен статистический анализ клинических и клинико-лабораторных показателей у больных с АГ и в контрольной группе. Распределение показателей систолического и диастолического АД, ОХС, ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП и ТГ отличалось от нормального по критерию Шапиро-Уилка (р<0,05), поэтому для сравнительного анализа больных и контроля по этим показателям использовали критерий Манна–Уитни. Расчеты проводились в программе STATISTICA for Windows 10.0.

Характер ассоциации полиморфных локусов с формированием заболевания оценивался при помощи показателя отношения шансов (ОR – от англ. odds ratio) и его 95% доверительного интервала (95% СI – от англ. confidence interval). При ОR>1 полиморфный вариант cчитали фактором риска развития заболевания, ОR<1 – протективным фактором формирования заболевания, ОR=1 – взаимосвязь отсутствовала. Определение несинонимичных полиморфных локусов (nsSNP – от англ. nonsynonymous single nucleotide polymorphism) и оценку их предикторного значения осуществляли с помощью программного обеспечения (SIFT – от англ. Sоrting Tolеrant Frоm Intоlerant) (https://sift.bii.a-star.edu.sg/). Регуляторный потенциал однонуклеотидных полиморфизмов изучался с помощью онлайн-программы HaploReg (v4.1) (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) [17]. Оценку влияния полиморфного маркера на экспрессию генов (cis-еQТL) проводили по данным проекта Gеnotype-Tissuе Exprеssion (GTEx) [18]. В исследование включались данные с p<8×10^-5, pFDR (от англ. – false discovery rate) ≤0,05. Направленность связи аллельных вариантов полиморфного локуса с уровнем транскрипции гена определяли по коэффициенту линейной регрессии (β), характеризующему изменение нормализованного показателя генной экспрессии на один полиморфный генетический вариант (http://www.gtexpоrtal.оrg/).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследование включен 821 пациент: 564 мужчины с ГБ и 257 индивидуумов контрольной группы. Характеристика обследованных групп представлена в таблице 1. Группы мужчин с ГБ и индивидуумы с нормотонией были сопоставимы по возрасту (р>0,05), но значимо отличались по ИМТ, уровню артериального давления, значениям ОС, ХС-ЛПВП и ХС-ЛПНП, ТГ (р<0,001). Среди мужчин, включенных в исследование, I степень АГ зарегистрирована у 54 пациентов (9,57%), II степень – у 196 (34,76%), III степень – у 314 (55,67%). Антигипертензивную терапию (ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, при необходимости – антагонисты рецепторов ангиотензина II, диуретики, комбинированные препараты) получали 462 пациента с АГ (81,91%), 102 мужчины (18,09%) не принимали антигипертензивных препаратов. Регулярно антигипертензивные препараты принимали 299 мужчин (53,01%), а 163 пациента (28,90%) лечились нерегулярно.

Таблица 1. Клинические характеристики больных с гипертонической болезнью и лиц контрольной группы

Примечание: данные представлены в виде абсолютного числа больных или среднего значения ± стандартное отклонение

Основные результаты исследования

Результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов полиморфных локусов металлопротеиназ у больных с ГБ и в контрольной группе в зависимости от наличия ожирения представлены в табл. 2. Примечательно, что в группах пациентов с ожирением и без ожирения с развитием ГБ ассоциированы различные полиморфные локусы ММР. Выявлено, что аллель А rs11568818 гена ММР7 повышает риск возникновения ГБ у лиц с ожирением (OR=2,01; 95% СI=1,21-3,36; р=0,01), а генотип GG этого гена, напротив, оказывает протективное влияние при развитии заболевания (OR=0,42; 95% СI=0,21–0,83; р=0,01). Установлено, что с высоким риском развития ГБ у мужчин без ожирения ассоциированы генетический вариант 6А rs3025058 гена MMР3 (OR=1,32; 95% СI=1,01–1,73; р=0,04) и генотип GG rs17577 MMР9 (OR=1,52; 95% СI=1,01–2,29; р=0,04). Генотип GА локуса rs17577, напротив, оказывает протективный эффект при развитии заболевания у мужчин без ожирения (OR=0,63; 95% СI=0,41–0,96; р=0,03).

Таблица 2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ у мужчин в зависимости от наличия ожирения

Примечание: OR – показатель отношения шансов; 95% CI – его 95% доверительный интервал; жирным выделены значимые различия.

Дополнительные результаты исследования

С использованием программного обеспечения HaploReg (v4.1) установлено, что полиморфный локус rs11568818 гена MMP7 располагается в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в клетках эндотелия, лимфобластоидных и гемопоэтических стволовых клетках, в головном мозге, поджелудочной и молочной железах. Данный локус располагается в области модифицированных гистонов (H3К4mе1 и H3К4mе3), маркирующих энхансеры и промоторы в 11 различных органах и тканях, в числе которых клетки периферической крови, эндотелиоциты, мезенхимальные стволовые клетки и др. Показано, что этот SNP локализован в сайтах связывания регуляторных белков TBP, c-FOS, c-Jun и в области регуляторных мотивов ДНК, отвечающих за связывание с 4 транскрипционными факторами. Выявлено, что аллель G повышает сродство к транскрипционным факторам Foxa_known1 (различие между ΔLOD scores (от англ. – logarithm of the odds) альтернативного (G) и референсного (А) аллелей составило -3,1), PLZF (ΔLOD scor=-1,5), Pou5f1_known2 (ΔLOD scor=-3,2) и снижает сродство к фактору транскрипции GR_known4 (LOD scor=0,8) (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php).

По данным базы HaploReg (v4.1), полиморфный маркер rs3025058 гена MMР3 локализован в регионе гистонов, маркирующих энхансеры (модифицированный гистон H3K4me1) в клетках эпителия и мезенхимы, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1 в тимусе и в регионе регуляторных ДНК-мотивов, служащих сайтами связывания с транскрипционными факторами СIZ и Gfi1b. Установлено, что аллель 6А, являющийся «рисковым» для развития ГБ у мужчин без ожирения, снижает аффинность к транскрипционным факторам CIZ (различие между LOD scores аллелей 6А (alt) и 5А (ref) составило 1,3) и Gfi1b (ΔLOD scor=1,7). Полиморфный вариант rs17577 определяет несинонимическую замену аргинина на глутамин (Arg668Gln) в экзоне 12 гена МMР9 (22q13.12). Выявлено, что SIFT Score данной аминокислотной замены составляет 0,02, что характеризует ее предикторное значение как DELETERIOUS (SIFT Score ≤0,05). Полиморфный маркер rs17577 располагается в регионе модифицированных гистонов (H3K4me1 и H3K4me3), которые маркируют энхансеры и промоторы в мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клетках, головном мозге, периферической крови, кардиомиоцитах и др. Локус находится в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в 22 тканях, а также локализован в сайтах связывания с регуляторными белками GAВP, CTСF, HАE2F1 и ZNF263.

С помощью онлайн-программы GTExpоrtal, которая содержит сведения об экспрессии генов в 48 различных органах и тканях in siliсo, проведен анализ ассоциаций rs11568818 ММР7 с уровнем экспрессии генов (http://www.gtexportal.org). Выявлено, что полиморфный аллель G rs11568818 ассоциирован с низким уровнем экспрессии гена ММР7 в поджелудочной железе (β=-0,31; р=5,1×10^-11; FDR≤0,05), легких (β=-0,35; р=8,1×10^-14; FDR≤0,05), коже (β=-0,23; р=3,9×10^-8; FDR≤0,05), желудке (β=-0,32; р=1,9×10^-6; FDR≤0,05), печени (β=-0,46; р=1,2×10^-5; FDR≤0,05).

Установлена связь полиморфного локуса rs17577 МMР9 с уровнями экспрессии гена SNX21 в скелетной мускулатуре (коэффициент линейной регрессии β аллеля G равен 0,19 при р=6,5×10^-6; FDR≤0,05) и гена SLC12A5 в подкожно-жировой клетчатке (β=0,71; р=1,9×10^-15; FDR≤0,05), аорте (β=0,66; р=3,3×10^-8; FDR≤0,05), коронарной артерии (β=0,66; р=1,4×10^-5; FDR≤0,05) и 9 других тканях (β=0,44–1,08; р=8,9×10^-22–3,1×10^-5).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании нами были установлены ассоциации полиморфных локусов ММР с развитием гипертензии у мужчин с ожирением и без ожирения. Установлена вовлеченность локуса rs11568818 гена ММР7 в развитие ГБ у лиц с ожирением. Получено, что данный полиморфный локус имеет значимый регуляторный потенциал – он расположен в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов, в области, гиперчувствительной к действию ДНКазы-1, а также влияет на уровень экспрессии гена ММР7 в различных тканях. Результаты нашего исследования согласуются с данными, полученными при изучении шведского населения, где также были установлены ассоциации rs11568818 ММР7 с развитием сердечно-сосудистой патологии у пациентов с гиперхолестеринемией (р<0,01) [19]. Согласно базе GeneCards, ген ММР7 входит в кластер генов на 11 хромосоме и кодирует протеиназу матрилизин, которая характеризуется отсутствием консервативного гемопексинового домена на C-конце. ММР7 участвует в протеолитическом расщеплении эластина, желатинов типа I, III, IV, V, фибронектинов, протеогликанов, отвечает за миграцию, пролиферацию и апоптоз клеток, участвует в процессах ремоделирования внеклеточного матрикса и регенерации при повреждениях (http://www.genecards.org/).

У мужчин без ожирения установлена вовлеченность локусов rs3025058 MMР3 и rs17577 MMР9 в формирование гипертонической болезни. Оба полиморфных локуса, согласно проведенному исследованию, характеризуются значимым регуляторным потенциалом, а локус rs17577 является несинонимичной заменой и влияет на уровень экспрессии генов SNX21 и SLC12A5. Полученные нами данные согласуются с результатами других ассоциативных исследований: локус rs3025058 ассоциирован с высокими показателями артериального давления в австралийской популяции [20], а генотип 6А/6А rs3025058 связан с высоким риском развития гипертензии и инфаркта миокарда у польского населения [21]. В то же время, согласно литературным данным, генотип АА rs17577 ММР9 ассоциирован с высоким риском развития сердечно-сосудистой патологии у индивидуумов с ожирением в бразильской популяции, что не согласуется с полученными в настоящем исследовании данными [22]. Наблюдаемые отличия могут обуславливаться этническими различиями анализируемых групп и дизайном исследования.

Согласно данным GeneCards, ген ММР3 кодирует протеолитический фермент ММР3 (стромелизин 1), который отвечает за деградацию основных компонентов артериальной стенки – фибронектина, ламинина, протеогликанов, желатинов I–V типа, коллагенов III, IV, IX, X. Стромелизин 1 секретируется многими клетками, в том числе эндотелиоцитами, и участвует в цитокиновой сигнализации, что ведет к активации неспецифического воспаления и развитию гипертензии. Ген ММР9 кодирует ММР9 (желатиназа В), которая синтезируется моноцитами, макрофагами, клетками опухолей и гидролизует коллагены IV и V типов. Желатиназа В участвует в IL8-индуцированной мобилизации гемопоэтических клеток-предшественников и выступает индуктором высвобождения цитокинов и факторов роста (http://www.genecards.org/).

Резюме основного результата исследования

Установлено, что у мужчин с ожирением в формирование ГБ вовлечены аллель А (OR=2,01; р=0,01) и генотип GG (OR=0,42; р=0,01) полиморфного локуса rs11568818 гена ММР7. У мужчин без ожирения с развитием заболевания ассоциированы аллель 6А (OR=1,32; р=0,04) rs3025058 гена MMР3 и генотипы GG (OR=1,52; р=0,04) и GА (OR=0,63; р=0,03) rs17577 гена MMР9.

Обсуждение основного результата исследования

В работе установлены ассоциации полиморфных локусов ММР с формированием ГБ у мужчин с ожирением и без ожирения. Полученные нами результаты согласуются с результатами других ассоциативных исследований, проведенных ранее в Швеции, Австралии и Польше. Полиморфные локусы rs11568818 ММР7, rs3025058 MMР3 и rs17577 MMР9, ассоциированные с развитием ГБ, характеризуются значимым регуляторным потенциалом – они располагаются в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов. Кроме того, локусы rs11568818 и rs17577 влияют на уровень экспрессии генов ММР7, SNX21 и SLC12A5. Наблюдаемые эпигенетические эффекты этих локусов могут быть медико-биологической основой их вовлеченности в развитие гипертонической болезни.

Ограничения исследования

Настоящее исследование имеет некоторые ограничения. Так, в работе рассматривались мужчины, но не рассматривались женщины; было проанализировано только восемь полиморфных локусов семи генов ММР; при формировании ГБ у больных с ожирением и без ожирения не анализировались ген-генные взаимодействия. Вышесказанное свидетельствует о необходимости проведения дальнейших исследований роли ожирения в реализации генетической предрасположенности к развитию ГБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в настоящем исследовании выявлено модифицирующее влияние ожирения в реализации генетической предрасположенности к развитию ГБ у мужчин: установлены ассоциации с развитием ГБ полиморфного локуса rs11568818 гена ММР7 у мужчин с ожирением и локусов rs3025058 MMР3 и rs17577 MMР9 у мужчин без ожирения. Показаны значимые эпигенетические эффекты анализируемых полиморфных маркеров – они располагаются в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов, а также влияют на уровень экспрессии генов ММР7, SNX21 и SLC12A5. Полученные данные расширяют представления о влиянии ожирения на реализацию наследственной предрасположенности к ГБ у мужчин.

Список литературы