Троицкая Н.И., Шаповалов К.Г., Мудров В.А.
Резюме
Актуальность. Сахарный диабет (СД) является одним из значимых заболеваний во всем мире. У 6-11% пациентов развивается синдром диабетической стопы (СДС), по поводу которого оперируются 40-70% больных. При развитии гнойно-некротического процесса у 50% больных с диабетической стопой выполняются ампутации, летальность после которых достигает 28-40%.
Цель – разработка модели прогнозирования риска развития СДС на основе комплексной оценки полиморфизмов генов факторов регуляции сосудистого тонуса, рецепторов тромбоцитов, ремоделирования сосудистой стенки, а также изменений состояния микроциркуляторного русла.
Материал и методы. У 198 пациентов с неосложненным СД и 199 больных с диабетической стопой исследовали полиморфизмы генов NOS3 с.-786Т>С, EDN1 c.594G>T (p.Lys198Asn), ITGB3 c.1565T>C, MMP9 c.-8202A>G, VEGFA c.-634C>G методом полимеразной цепной реакции. У 30 больных из каждой группы, сопоставимых по частоте полиморфизмов исследуемых генов, исследовали состояние микроциркуляторного русла с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии. Исследование носило проспективный характер. Анализ результатов включал соответствие закону Харди-Вайнберга, χ2, отношение шансов и его доверительный интервал, критерий Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони, показатель V-Крамера, нелинейный регрессионный анализ.
Результаты. Установлена ассоциация полиморфизма ITGB3 c. 1565T>C в гетерозиготном состоянии с риском развития диабетической стопы. Выявлена связь показателя общей микроциркуляции, среднего колебания перфузии, максимальной амплитуды осцилляций нейрогенного, миогенного, дыхательного, сосудистого диапазонов в точке на предплечье, показателя общей микроциркуляции и коэффициента вариации в точке на тыле и I пальце стопы с развитием СДС. С помощью метода нелинейного регрессионного анализа на основе полученных данных создана прогностическая модель для определения относительного риска развития СДС у конкретного пациента.
Заключение. Площадь под ROC-кривой для разработанной модели составила 80,1%, что свидетельствует о хорошей информативности разработанной модели и делает возможным ее применение в клинической практике для оценки индивидуального риска развития СДС.
Сахарный диабет (СД) является одной из значимых медико-социальных и экономических проблем как в России, так и за рубежом в связи с высокой распространенностью и развитием большого числа тяжелых осложнений [1-3]. Общая численность пациентов с данным заболеванием на декабрь 2016 г. в Российской Федерации составила 4 млн 348 тыс. человек, из которых 92% больных страдали СД 2-го типа [2].
При СД в 6-11% случаев развивается синдром диабетической стопы (СДС), по поводу которого у 40-70% больных возникает необходимость в различных видах оперативного лечения [4, 5]. Из нетравматических причин выполнения ампутаций более 50% приходится на развитие гнойнонекротического процесса на фоне СДС, летальность после которых достигает 28-40%, а 5-летняя выживаемость составляет 25-40% [6, 7].
Многими современными исследованиями подтверждается мультифакторный характер природы СДС, большое значение в развитии которого играют микроангиопатия, нарушения микроциркуляции и эндотелиальная дисфункция [8-12]. В настоящее время активно ведется изучение показателей, лежащих в основе патогенеза развития данного осложнения и роли полиморфизмов генов, ассоциированных с продукцией изучаемых биологически активных веществ.
В эпоху персонализированной медицины широкое применение находит разработка различных прогностических моделей, основанных на сочетании нескольких факторов риска, ассоциированных с развитием заболевания, для возможности предсказания и предупреждения возникновения различных фатальных осложнений.
Цель работы – разработка модели прогнозирования риска развития СДС на основе комплексной оценки полиморфизмов генов факторов регуляции сосудистого тонуса, рецепторов тромбоцитов, ремоделирования сосудистой стенки, а также изменений состояния микроциркуляторного русла.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 198 пациентов с неосложненным течением СД и 199 больных со смешанной формой СДС, находившихся на стационарном лечении в ГУЗ “ГКБ № 1” г. Читы в период с 2016 по 2018 г. Проводимая научная работа была одобрена этическим комитетом Читинской государственной медицинской академии (протокол заседания № 74 от 06.11.2015). Исследование выполнялось в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2013). Лабораторные исследования проводились на базе НИИ молекулярной медицины ФГБОУ ВО ЧГМА Минздрава России.
Диагноз СД у больных в исследуемых группах был выставлен на основании критериев, описанных в утвержденных Минздравом России клинических рекомендациях “Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом” (2015, 2017) [13, 14]. Исследование включало 3 этапа: 1-й этап – исследование полиморфизмов NOS3 с.-786Т>С, EDN1 c.594G>T (p.Lys198Asn), ITGB3 c.1565T>C, MMP9 c.-8202A>G, VEGFA c.-634C>G и в клинических группах, а также выявление их ассоциации с развитием диабетической стопы; 2-й этап – исследование состояния микроциркуляторного русла у 30 больных с неосложненным течением СД и 30 пациентов с развитием СДС, участвовавших в 1-м этапе исследования, сопоставимых по частоте распределения полиморфизмов исследуемых генов; 3-й этап – выявление связи между показателями микроциркуляции и полиморфизмами генов, ассоциированных с развитием диабетической стопы и создание на их основе прогностической модели.
Генотипирование исследуемого полиморфизма проведено на геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов цельной крови с использованием реагента “Проба Рапид” производства ООО “ДНК-Технология” (г. Москва). Исследование проводилось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (амплификатор “ДТ-96”, ЗАО “НПФ ДНК-Технология”, г. Москва) с использованием набора реактивов: NOS3 с.-786Т>С, EDN1 c.594G>T (p.Lys198Asn), ITGB3 c.1565T>C, MMP9 c.-8202A>G, VEGFA c.-634C>G (ООО Научно-производственная фирма “Литех”, г. Москва) согласно инструкции производителя.
Состояние микроциркуляторного русла оценивали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью аппарата ЛАКК-02 (НПП “Лазма”, Россия). Обследование проводили с соблюдением стандартных условий для методики лазерной допплеровской флоуметрии. Исследование системной микроциркуляции осуществляли в точке на нижней трети предплечья, расположенной по срединной линии на 4 см выше основания шиловидных отростков локтевой и лучевой кости, локальную микроциркуляцию регистрировали в точках на тыле стопы в 1-м межплюсневом промежутке и на подошвенной поверхности I пальца стопы. Оценивали следующие показатели: показатель микроциркуляции (М), среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения М (σ), коэффициент вариации (Кv). С помощью вейвлет-анализа устанавливали показатели максимальных амплитуд: эндогенного (Аэ), нейрогенного (Ан), миогенного (Ам), дыхательного (Ад) и сосудистого (Ас) диапазонов колебаний микрокровотока. Перечисленные показатели, кроме Kv, измеряли в перфузионных или относительных единицах (пф.ед., отн.ед.), Kv определяли в процентах.
При проведении статистического анализа авторы руководствовались принципами Международного комитета редакторов медицинских журналов (ICMJE) и рекомендациями “Статистический анализ и методы в публикуемой литературе” (SAMPL) [15]. Номинальные данные описывали с указанием абсолютных значений, процентных долей. Оценка статистической значимости различий показателей исследования проводилась за счет построения произвольной таблицы сопряженности с использованием критерия χ2 Пирсона. Зависимость относительных показателей оценивалась путем сравнения полученного значения критерия χ2 с критическим (определяло уровень значимости p). Учитывая наличие результативных и факторных признаков, проспективный анализ исследования, оценка значимости различий показателей проводилась за счет определения отношения шансов (ОШ). Статистическая значимость относительного риска оценивалась исходя из значений 95% доверительного интервала (95% ДИ). Значение уровня двусторонней значимости р<0,05 рассматривалось как статистически значимое.
В связи с тем что показатели микроциркуляторного русла и маркеры дисфункции эндотелия оценивались у 30 пациентов каждой группы, оценка нормальности распределения показателей микроциркуляции проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Полученные данные представлены в виде медианы и интерквартильного интервала [Ме (25%; 75%)]. Для описания наблюдаемых тенденций при сравнении групп использован критерий Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони при оценке значения р. Статистически значимыми отличия считались при р≤0,05.
Силу связи между изучаемыми показателями и развитием СДС оценивали по величине показателя V-Крамера и отношению шансов. Значение уровня двухсторонней значимости р<0,05 рассматривалось как статистически значимое. В последующем на основании уравнения нелинейной регрессии разработана прогностическая модель, эффективность которой оценивалась на основании площади под ROC-кривой. Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась с помощью пакета программ IBM SPSS StatisticsVersion 25.0.
Результаты и обсуждение
Обследуемые нами на первом этапе частоты генотипов изучаемых генов пациентов с неосложненным течением СД и с развитием СДС соответствовали закону Харди-Вайнберга, что позволило нам сравнивать носительство этих полиморфизмов в исследуемых группах.
При исследовании частоты полиморфизмов генов NOS3 с.-786Т>С, EDN1 c.594G>T (p.Lys198Asn), MMP9 c.-8202A>G, VEGFA c.-634C>G достоверно значимых отличий между группами больных нами не выявлено, также не определена ассоциативная связь между частотой полиморфизмов вышеуказанных генов и развитием СДС. Статистически значимые результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Частота генотипов полиморфизмов и частота аллелей в исследуемых группах (df=2)
Примечание. СД – сахарный диабет; СДС – синдром диабетической стопы; n – количество обследованных; χ² – хи-квадрат; ДИ – доверительный интервал; p – уровень значимости между группами. Жирным шрифтом выделены значимые результаты.
Одной из причин возникновения ангиопатий при СД, приводящих к развитию СДС, является повышение свертываемости крови и агрегации тромбоцитов [8]. Процесс агрегации тромбоцитов заканчивается конформационным изменением комплекса GPIIb/IIIa, преобразующегося в рецептор для фибриногена. Субъединица GPIIIa кодируется геном ITGB3 [16]. В настоящее время выявлено около тысячи однонуклеотидных полиморфных вариантов, многие из которых ассоциированы с развитием различной патологии [17].
По полученным нами данным выявлены значимые различия между полиморфизмами ITGB3 c.1565T>C. Распространенность генотипа ITGB3 c.1565T>C в гомозиготном состоянии при неосложненном СД была выше, чем при развитии диабетической стопы, и составила 71,2%. В то же время при развитии диабетической стопы чаще, чем при СД без осложнений, встречался генотип ITGB3 c.1565T>C в гетерозиготном состоянии [37,7 и 28,3% соответственно (χ²=6,243, р=0,045)]. Нами выявлено, что риск развития диабетической стопы при данном варианте генотипа в 1,5 раза выше, чем при других полиморфизмах данного гена ([ОШ=1,534 (95% ДИ 1,006-2,338), р<0,05]. По частоте встречаемости варианта гомозиготного генотипа ITGB3 c.1565T>C значимых различий между группами не выявлено.
На 2-м этапе работы у 30 больных с диабетической стопой и 30 пациентов с СД без осложнений, сопоставимых по частоте встречаемости полиморфизмов генов, полученных ранее, нами обследовано состояние микроциркуляторного русла. В табл. 2 представлены статистически значимые результаты исследования.
Таблица 2. Показатели микроциркуляции при различных вариантах течения сахарного диабета [Ме (25-й; 75-й)]
Примечание. Здесь и в табл. 3: СДС – синдром диабетической стопы; пф. ед. – перфузионные единицы; n – число обследованных; р – уровень значимости различий между группами; жирным шрифтом выделены значимые результаты.
Показатель М характеризует общую усредненную стационарную перфузию микрососудов за время проведения исследования и определяется скоростью движения эритроцитов, тканевым гематокритом, а также количеством функционирующих капилляров [18, 19]. По полученным нами данным, значение М при СДС ниже, чем при неосложненном СД, в 1,4 раза в точке на предплечье, в 1,8 раза в точке на стопе и в 1,5 раза в точке на I пальце стопы (р=0,031, 0,003, 0,004).
Параметр σ характеризует временную изменчивость перфузии, отражает среднюю модуляцию кровотока во всех частотных диапазонах [18]. Значение показателя σ в точке на предплечье при СДС достоверно ниже, чем при СД, в 1,6 раза (р=0,001).
Kv отражает выраженность вазомоторной активности сосудов микроциркуляторного русла [19, 20]. По результатам нашего исследования, в точках на стопе и I пальце стопы выявлено статистически значимое повышение уровня Kv при СДС по сравнению с неосложненным течением СД в 1,7 и 1,5 раза соответственно.
Активные факторы контроля микроциркуляции модулируют поток крови со стороны сосудистой стенки и реализуются через ее мышечный компонент. К ним относятся эндотелиальный, миогенный и нейрогенный механизмы регуляции просвета сосудов [20]. При проведении лазерной допплеровской флоуметрии состояние этих механизмов отражают максимальные амплитуды осцилляций эндотелиального, миогенного и нейрогенного колебаний (Аэ, Ан, Ам). К пассивным компонентам регуляции микрососудистого тонуса относятся пульсовая волна со стороны артерий и присасывающее действие “дыхательного насоса” со стороны вен [18]. Состояние этих механизмов характеризуют амплитуды флуктуации в дыхательном и пульсовом диапазонах (Ад, Ас).
По полученным нами данным, статистически значимые различия между показателями Ан, Ам, Ад, Ас в группах больных выявлены только в точке на предплечье. У пациентов с СДС отмечается снижение значений Ан, Ам, Ад, Ас по сравнению с неосложненным течением СД в 1,5; 1,3; 1,5 и 1,4 раза соответственно.
В ходе третьего этапа исследования нами проанализирована связь между значимыми изменениями показателей состояния микроциркуляции и развитием СДС (табл. 3).
Таблица 3. Связь между развитием синдрома диабетической стопы и показателями микроциркуляторного русла
При анализе полученных данных нами установлена значимая ассоциативная связь между показателями М, σ, Aд, Ac в точке на нижней трети предплечья и развитием СДС средней силы (χ²=3,807, р=0,05, V-Крамера=0,256; χ²=8,287, р=0,004, V-Крамера=0,395; χ²=4,026, р=0,045, V-Крамера=0,266; χ²=9,247, р=0,02, V-Крамера=0,396). Вместе с тем в данной точке не выявлено достоверной связи между уровнем Ан, Ам и развитием СДС. В точках на тыле и I пальце стопы показатели М и Кv достоверно ассоциировались с риском развития диабетической стопы, сила связи оценена как средняя (χ²=6,669, р=0,01, V-Крамера=0,334; χ²=4,026, р=0,045, V-Крамера=0,266; χ²=5,934, р=0,015, V-Крамера=0,314; χ²=5,224, р=0,022, V-Крамера=0,303).
На основе значимо ассоциированных с СДС показателей микроциркуляции с помощью метода нелинейного регрессионного анализа нами получена модель, позволяющая определить средний относительный риск развития СДС. Для его расчета у конкретного пациента, являющегося носителем полиморфизма ITGB3 c.1565T>C в гетерозиготном состоянии, необходимо рассчитать средний относительный риск (ОР) по формуле:
OР = 0,1 × (0,846 × Мz + 1,655 × σz + 0,912 × Aдz + 0,9965 × Acz + 1,055 × Ms + 0,912 × Kvs + 1,25 × Мp + 0,863 × Kvp),
где Мz – показатель микроциркуляции в точке на предплечье, σz – среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения М в точке на предплечье, Aдz – показатель максимальной амплитуды дыхательного диапазона в точке на предплечье, Acz – показатель максимальной амплитуды сосудистого диапазона в точке на предплечье, Ms – показатель микроциркуляции в точке на тыле стопы, Kvs – коэффициент вариации в точке на тыле стопы, Мp – показатель микроциркуляции в точке на I пальце стопы, Kvp – коэффициент вариации в точке на I пальце стопы. Для использования в формуле значения параметров микроциркуляторного русла необходимо перевести в баллы (табл. 4).
Таблица 4. Балльная шкала кодировки параметров, использованных в формуле
На основании полученного результата оценивается средний относительный риск развития данного осложнения у конкретного пациента относительно среднего риска в популяции.
На основе полученной модели построена ROC-кривая, площадь под которой составила 80,1%, что свидетельствует о ее высокой чувствительности и специфичности (см. рисунок).
Площадь под ROC-кривой для прогностической модели
Area under the ROC curve for the predictive model
У 30 пациентов с СДС и 30 пациентов без осложнений СД, являющихся носителями полиморфизма ITGB3 c.1565T>C, нами исследовано состояние микроциркуляторного русла и проведен расчет относительного риска по формуле. При развитии диабетической стопы среднее значение показателя в группе составило 0,75. В группе с СД без осложнений среднее значение показателя составило 0,54. При динамическом контроле через 1 год у 3 обследованных пациентов с неосложненным течением СД, являющихся носителем полиморфизма ITGB3 c.1565T>C, отмечалось развитие СДС. Исходно по формуле у данной группы больных уровень значения показателя относительного риска, рассчитанного по формуле, составил выше 0,54.
На основании вышеизложенного мы предположили, что при значении полученного показателя выше 0,54 больного, являющегося носителем полиморфизма ITGB3 c.1565T>C, следует отнести к группе повышенного риска развития СДС, нуждающегося в более частом диспансерном наблюдении для раннего выявления факторов, предрасполагающих к развитию данного осложнения, обеспечения своевременной коррекции гипергликемии и возникающих патологических состояний, обязательном обучении правильному уходу за стопами и контролю усвоения данного навыка.
Заключение
Установлена связь генетического полиморфизма ITGB3 c.1565T>C в гетерозиготном состоянии, ряда показателей, характеризующих состояние микроциркуляторного русла, определяемых в различных точках, с развитием СДС. С помощью метода нелинейного регрессионного анализа на их основе создана прогностическая модель для определения относительного риска развития СДС у конкретного пациента, позволяющая выделить группу больных, имеющих повышенный риск развития данного осложнения и нуждающихся в регулярном наблюдении. По средствам ROC-анализа выявлено хорошее качество разработанной модели. Высокая информативность модели открывает ее возможности использования в клинической практике для определения риска развития СДС. Исследование изменений состояния микроциркуляции имеет особую важность для расчета относительного риска именно у лиц, являющихся носителями генетического полиморфизма ITGB3 c.1565T>C.
Список литературы смотрите здесь.
Источник: Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2022. Т. 10, № 2. С. 46-53.